yy.vip易游-基于多组学研究人参皂苷Rb3抑制巨噬细胞脂质积累的作用机制

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　　动脉粥样硬化是一种以慢性炎症和脂质代谢紊乱为特征的心血管疾病，其中巨噬细胞异常摄取氧化低密度脂蛋白（）并发生脂质蓄积，是泡沫细胞形成和斑块进展的关键环节。脂质相关巨噬细胞（）被认为是动脉粥样硬化及代谢性炎症疾病中的关键细胞亚群，其形成与功能异常与脂质摄取、外排失衡及多条代谢信号通路密切相关模型，结合非靶向脂质组学、转录组学和蛋白质组学，从脂质组成变化、基因转录调控及蛋白表达水平多维度系统解析

　　RAW264.7小鼠单核巨噬细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养。

　　2.1.1细胞活力检测采用CCK-8检测试剂盒考察Rb3对巨噬细胞活力的影响。将对数生长期的RAW264.7细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，培养过夜，用含Rb3（25、50、100 μmol/L）的无血清培养基处理24 h[12]。对照组加入不含药物的培养基，另设置未接种细胞的空白组。加入含10% CCK-8溶液的无血清培养基，孵育2 h。用酶标仪在450 nm处测量各孔的吸光度（A）值，计算细胞存活率。

　　2.1.2油红O染色检测脂质积累设置对照组、模型组和Rb3低、高剂量（50、100 μmol/L）组，用含50 μg/mL ox-LDL的无血清培养基诱导巨噬细胞建立LAMs模型[13]，给药组再加入Rb3处理24 h。弃去培养液，4%多聚甲醛固定20 min，60%异丙醇浸洗15 s，加入油红O染液染色20 min，纯水洗涤后于倒置显微镜下拍照，观察脂质积累变化。

　　2.1.3脂滴绿色荧光染色检测脂质积累按“2.1.2”项下方法进行分组和给药，按照脂滴绿色荧光检测试剂盒步骤，检测各组细胞中脂质积累的变化。细胞用4%多聚甲醛固定15 min，加入Staining Solution避光孵育20 min，洗涤后于cytation仪器GFP模式下拍照，并于Ex/Em（488 nm/525 nm，Ex代表激发，Em代表发射）下检测发光强度。

　　按“2.1.2”项下方法进行分组和给药，用预冷的PBS刮下细胞，800 r/min离心5 min，与氯仿-甲醇（2∶1）混合，涡旋，4℃、12 000 r/min离心10 min。取下层有机相，重复操作，使用真空离心干燥。加入甲醇-异丙醇（1∶1）混合物复溶，4℃、12 000 r/min离心10 min，吸取上清进行脂质组学分析。按照课题组前期研究的方法[14]，采用高分辨率液相色谱-质谱（LC-MS）检测和分析主要脂质。

　　在脂质代谢组学分析得到的结果中，以变量权重值（variable importance for projection，VIP）＞1、P＜0.05、差异倍数（fold change，FC）＞2或＜0.5为条件筛选脂质代谢物，选择对照组vs模型组与模型组vsRb3高剂量组同时满足上述筛选条件的差异脂质，将其导入LIPEA网站进行通路富集分析。

　　按“2.1.2”项下方法进行分组和给药，收集细胞，加入Trizol试剂后送样检测。使用MJzol Animal RNA Isolation Kit进行总RNA的提取，使用RNAClean XP Kit和RNase-Free DNase Set进行纯化。对纯化后的总RNA进行mRNA的分离、片段化、第一链cDNA合成、第二链cDNA合成、末端修复、3’末端加A、连接接头、富集等步骤，完成mRNA测序文库的构建。根据文库的有效浓度及数据产出需求进行测序。使用Illumina NovaSeq 6000测序平台，采用PE150测序模式，使用Cel Ranger 4.0.0软件和Cellranger aggr插件对数据归一化，进行主成分分析（principal components analysis，PCA）和无监督聚类。使用Seqtk过滤原始数据，使用Hisat 2.2.0.4进行基因组对比，使用Stringtie软件统计每个基因内的片段数量，并采用TMM算法进行标准化处理。使用edgeR进行mRNA差异表达分析。

　　在转录组学分析得到的结果中，以P＜0.05、FC＞2或＜0.5为条件筛选差异表达基因，选择对照组vs模型组与模型组vsRb3高剂量组同时满足上述筛选条件的差异表达基因，将其导入微生信进行通路富集分析。

　　按“2.1.2”项下方法进行分组和给药，收集细胞，按照文献方法进行样品处理和检测[15]。加入尿素与2% SDS裂解细胞蛋白，超声破碎后4℃、13 000 r/min离心20 min，吸取上清，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，加入6倍体积的冰丙酮沉淀蛋白，−20℃沉淀过夜后，4℃、13 000 r/min离心15 min，沉淀加预冷洗液洗涤2次，于通风橱风干至半干状态。加入盐酸胍复溶沉淀，4℃、13 000 r/min离心10 min，取上清测定蛋白浓度。使用巯基乙醇溶液还原蛋白，加入IAM溶液烷基化蛋白质，使用超滤管收集基化后的蛋白，加入胰酶，37℃摇床90 r/min反应过夜，收集肽段进行脱盐处理，1%甲酸水溶液复溶样品后上机检测。采用纳米电喷雾液相色谱质谱（Nano-ESI-LC-MS）检测蛋白，进行数据库鉴定与定量。

　　在蛋白质组学分析得到的结果中，以P＜0.05、FC＞2或＜0.5为条件筛选差异表达蛋白，选择对照组vs模型组与模型组vsRb3高剂量组同时满足上述筛选条件的差异表达蛋白，使用微生信进行通路富集分析。

　　2.6.1qRT-PCR分析按“2.1.2”项下方法进行分组和给药，收集细胞，按照试剂盒说明书提取总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列见表1，采用2−∆∆Ct法计算目的基因的表达量。

　　2.6.2Western blotting分析按“2.1.2”项下方法进行分组和给药，收集细胞，用含1%磷酸酶抑制剂的RIPA裂解总蛋白，并进行蛋白定量。蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，封闭后，分别加入Cd36（1∶5 000）、C5ar1（1∶1 000）、Abcg1（1∶500）和GAPDH（1∶5 000）抗体，4℃孵育过夜；洗膜后，室温孵育二抗（1∶5 000），加入ECL化学发光试剂显影，使用Image J软件分析条带的灰度值。

　　2.6.3细胞热位移实验（cellular thermal shift assay，CETSA）选择生长状态良好的RAW264.7细胞，离心后加入含1%磷酸酶抑制剂的PBS，使用液氮速冻、水浴37℃解冻裂解细胞，离心后进行蛋白定量。将上清分为2份，分别为对照组（0.1%二甲基亚砜）和Rb3（100 μmol/L）组，室温孵育1 h后分别分为4份，分别于逆转录仪42、52、62、72℃处理3 min，提取蛋白，按“2.6.2”项下方法检测Cd36和C5ar1蛋白表达。

　　使用Graphpad Prism 9.5软件进行统计分析和绘图，数据以表示，使用单因素方差分析进行多组间数据样本比较。

　　CCK-8结果（图1-C）显示，Rb3（25、50、100μmol/L）对RAW264.7细胞无明显毒性。绿色脂滴及油红O染色结果（图1-A、B、D、E）显示，经ox-LDL诱导后，巨噬细胞内的脂质积累明显升高（P＜0.001），表明LAMs模型造模成功；与模型组比较，Rb350、100μmol/L给药后显著抑制LAMs中的脂质积累（P＜0.05、0.01、0.001），且呈剂量相关性，Rb325μmol/L给药后与模型组无显著性差异，故后续实验以Rb350、100μmol/L的剂量给药。

　　PCA结果（图2-A）显示，模型组与Rb3低剂量组在同一象限，与对照组、Rb3高剂量组分居不同象限，组内样本聚集分布，提示对照组、模型组、Rb3高剂量组脂质成分区分明显。火山图（图2-B、C）显示对照组vs模型组与模型组vsRb3高剂量组脂质分子整体FC情况，以FC＞2或＜0.5、P＜0.05筛选差异脂质。弦图（图2-D、E）及热图（图3-B）显示组间脂质变化的聚类，可见大部分甘油磷酯差异脂质水平在造模后提高，Rb3处理后降低；大部分甘油磷脂差异脂质水平在造模后提高，Rb3处理后降低，提示LAM造模后细胞发生脂质紊乱，而Rb3干预后能逆转脂质紊乱。将差异脂质导入LIPEA网站进行通路富集分析，以P＜0.05为筛选标准，差异最为显著的是甘油磷脂通路（图3-A）。

　　如图4所示，以FC＞2或＜0.5、P＜0.05筛选差异表达基因，结果如图4-A、B所示，对照组vs模型组有1 291个差异表达基因，模型组vsRb3高剂量组有1 083个差异表达基因，3组共有601个交集基因，其中256个交集基因在模型组上调，在Rb3高剂量组下调；341个交集基因在模型组下调，在Rb3高剂量组上调。对上述601个差异表达基因进行基因本体（gene ontology，GO）分析，结果见图4-D，生物过程注释表明差异基因与对外部刺激的负调控反应、防御反应的负调控、羧酸生物合成等相关；细胞成分注释表明差异基因主要与液泡膜、极化生长位点、前突触等相关；分子功能注释分析表明差异基因主要与抗氧化活性、钙离子跨膜转运蛋白活性、钙通道活性等相关。京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路结果（图4-C）显示，交集基因富集于PPAR信号通路、谷胱甘肽代谢、胞葬作用等[16]。

　　如图5所示，以FC＞2或＜0.5、P＜0.05筛选差异表达蛋白，结果如图5-A、B所示，对照组vs模型组有510个差异表达蛋白，模型组vsRb3高剂量组有434个差异表达蛋白，3组共有254个交集蛋白，其中116个交集蛋白在模型组上调而在Rb3高剂量组下调，138个交集蛋白在模型组下调而在Rb3高剂量组上调。对对照组、模型组和Rb3高剂量组共有的254个差异表达蛋白进行GO分析，结果见图5-D，生物过程注释表明差异表达蛋白与含蛋白质复合物组装的调控、细胞内运输调控、肌动蛋白丝组织等相关；细胞成分注释表明与细胞质小核糖体亚基、髓鞘、细胞质核糖体等相关；分子功能注释分析表明与肌动蛋白结合、肌动蛋白丝结合、微管蛋白结合等相关。KEGG通路结果（图5-C）显示，差异表达蛋白富集于肌萎缩侧索硬化、帕金森病、朊病毒病等主要通路。

　　如图7所示，与对照组比较，模型组Cd36、C5ar1基因及蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01），Abcg1基因及蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），Abca1、PPARγ基因表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，Rb3高剂量组Cd36、C5ar1基因及蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01、0.001），Abcg1基因及蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），Abca1、PPARγ基因表达水平显著升高（P＜0.05），Rb3低剂量组Cd36、C5ar1基因表达水平显著降低（P＜0.05）。

　　如图8所示，随温度提高，Cd36和C5ar1蛋白条带均有降解趋势。在相同温度下，与对照组比较，Rb3处理后Cd36和C5ar1的蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01），表明Rb3和Cd36、C5ar1存在结合作用，能够提高蛋白的热稳定性而抑制其随温度提高的降解。